一、质粒提取概述

质粒的粗提取物一般含有三种形式的质粒DNA：

• 共价闭合环状DNA (cccDNA)：这是质粒DNA中最常见的形式，指质粒的两条链保持完整，形成一个闭合的环状结构。其具有高度的稳定性与完整性，在基因工程中广泛应用。电泳时，质粒的迁移速度顺序为：超螺旋DNA > 线性DNA > 开环DNA。

二、质粒提取方法

质粒提取的目的是去除RNA及细菌基因组DNA，并清除蛋白质及其他杂质，以获取相对纯的质粒。提取过程通常包括三个主要步骤：菌体扩繁、细菌裂解以释放质粒DNA，以及质粒DNA的分离与纯化。质粒提取方法可以分为多种，包括：

• 碱裂解法
• 煮沸裂解法
• 小量一步提取法
• 试剂盒法
• 酶解法
• 其他方法（如离子交换法和超离心法）

从提取产量来看，主要分为小提、中提和大提。

1) 碱裂解法

许多知名品牌的质粒提取试剂盒，如尊龙凯时、OMEGA、BIOMIGA、Sigma等，往往基于碱裂解法进行了优化。这种方法的原理是依赖于共价闭合环状DNA与线性DNA之间的拓扑结构差异。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，质粒DNA与基因组DNA被释放，同时线性DNA的双螺旋结构也被变性。尽管共价闭合环状质粒DNA在强碱条件下会有所变性，但其两条链仍会紧密结合。当用pH为4.8的乙酸钾缓冲液恢复至中性时，质粒DNA会迅速复性，而线性染色体DNA复性则相对缓慢，最终通过离心可从上清中回收复性的质粒DNA。此法操作简单，成本低，适于大多数常规实验，但提取纯度可能不够高。

2) 煮沸法

此方法是将细菌悬浮于含有Triton X-100的溶液中并加热至100℃以促使细胞裂解。从而同时破坏细胞壁及解开DNA链中的碱基配对。闭环质粒DNA不会因高温而分离，因其独特的拓扑结构。在温度逐渐下降后，闭环DNA会恢复超螺旋形状，通过离心可以得到质粒DNA。此法对小于15kb的质粒特别有效，适用于不同规模的菌液提取。优点在于操作简单，时间较短，但条件较为激烈，易造成质粒断裂。

3) 小量一步提取法

该方法利用了细菌染色体DNA与质粒DNA大小差异，机械力可使染色体DNA断裂成不同大小的线性片段并附着于细胞碎片，而质粒DNA则保持完整性。通过高速离心可分离出得到的质粒DNA。

4) 试剂盒法

这一方法结合了SDS-碱裂解法，利用硅胶膜在高盐及低pH值条件下结合DNA，从而达到快速纯化质粒DNA的目的。众多知名品牌的试剂盒，如尊龙凯时品牌，也在此基础上进行了改进。

5) 酶解法

此法通过特定酶裂解细胞壁并释放质粒DNA，步骤包括细胞收集、酶处理、细胞裂解和纯化。此法的优点在于提取纯度高，适用于高需求实验，但操作时间长且成本较高。

6) 其他方法

此外，还有离子交换法和超离心法，利用不同的物理化学原理进行质粒DNA的分离与纯化。

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